La respuesta heterogénea de las células cancerosas a la radiación exige estudios exhaustivos sobre la supervivencia celular, que a menudo se realizan mediante ensayos clonogénicos. Estos ensayos implican un recuento manual laborioso y subjetivo de las colonias celulares. En este proyecto se presenta una técnica innovadora de procesamiento de imágenes digitales para el recuento automatizado de colonias celulares. Esta investigación se centró en las células HT-29 (cáncer de colon). La metodología utiliza técnicas de Hough para lograr una detección precisa, morfología matemática y el establecimiento del tamaño mínimo óptimo de las colonias mediante la curva ROC. Este enfoque se integró perfectamente en el software ImageJ como un complemento de ColCounter. Las imágenes con una resolución de 1200 × 1200 píxeles alcanzaron una sensibilidad y una especificidad del 92,88 % y del 92,62 %, respectivamente. Para determinar la eficacia del software en el análisis de imágenes de diferentes resoluciones en comparación con el recuento manual, se llevó a cabo una evaluación de la fiabilidad del método automatizado. Los resultados revelaron un coeficiente de correlación intraclase (ICC) global de 0,89 (IC del 95 %: 0,81-0,93). Los límites de concordancia se determinaron utilizando el método de Bland-Altman. La metodología propuesta demostró ser intercambiable con la técnica convencional de recuento manual. Los resultados confirman el elevado rendimiento del software, incluso en contextos alterados. ColCounter ofrece una función de edición manual, lo que mejora su utilidad como herramienta optimizada, rápida y precisa para cuantificar colonias de células tumorales en ensayos clonogénicos.